Génie génétique

1. Une séquence est palindromique si elle est identique à sa séquence complémentaire lue de 5' vers 3'.

2. Le motif GAATTC apparaît deux fois (positions 3 à 8 et 15 à 20). Le fragment linéaire possède 2 sites et donne donc $2 + 1 = 3$ fragments. La coupe a lieu après le G de chaque site. Le brin supérieur est coupé en : CGG (3 nucléotides), AATTCTTAGGCG (12 nucléotides) et AATTCACGT (9 nucléotides), soit $3 + 12 + 9 = 24$ nucléotides, la longueur du fragment de départ.

3. EcoRI coupe les deux brins à des endroits décalés : chaque extrémité garde une courte partie simple brin, AATT. Deux extrémités coupées par EcoRI sont complémentaires et peuvent s'apparier par liaisons hydrogène (elles « collent »), quelle que soit l'origine de l'ADN. La ligase soude ensuite l'ensemble.

1. Ordre : c, b, f, a, e, d.

2. L'enzyme de restriction coupe l'ADN à un site précis et crée des extrémités cohésives. La ligase soude le gène au plasmide. Le plasmide est le vecteur : il transporte le gène et se réplique dans la bactérie. L'antibiotique permet de ne garder que les bactéries qui ont reçu le plasmide, porteur du gène de résistance.

3. Le code génétique est quasi universel : la bactérie lit les codons du gène humain comme les siens et fabrique le même polypeptide, à condition que le gène soit sans introns (ADNc) et placé sous un promoteur actif chez la bactérie.

1. Un ADN linéaire coupé en 2 fragments possède 1 site : EcoRI a 1 site, BamHI a 1 site.

2. Le site EcoRI est à 1 800 pb de l'extrémité gauche (on oriente la carte ainsi : la carte inversée serait équivalente). BamHI donne 3 500 et 2 500 pb : son site est soit à 2 500 pb, soit à 3 500 pb de l'extrémité gauche.

• Si BamHI est à 2 500 pb : fragments de la double digestion $1\,800$, $2\,500 - 1\,800 = 700$ et $6\,000 - 2\,500 = 3\,500$ pb. Ce sont les données.
• Si BamHI est à 3 500 pb : fragments $1\,800$, $3\,500 - 1\,800 = 1\,700$ et $6\,000 - 3\,500 = 2\,500$ pb. Ce n'est pas ce qui est observé (pas de fragment de 700 ni de 3 500).

Le site BamHI est donc à 2 500 pb de l'extrémité gauche, soit à 700 pb après le site EcoRI.

3. Carte : extrémité gauche, 1 800 pb, site EcoRI, 700 pb, site BamHI, 3 500 pb, extrémité droite. La somme vaut $1\,800 + 700 + 3\,500 = 6\,000$ pb. Avec EcoRI seule : 1 800 et $700 + 3\,500 = 4\,200$. Avec BamHI seule : $1\,800 + 700 = 2\,500$ et 3 500. Tout est cohérent.

4. Les plus petits fragments migrent le plus loin : le fragment de 700 pb est le plus proche du pôle positif (le plus éloigné du puits), puis celui de 1 800 pb, et le fragment de 3 500 pb reste le plus proche du puits.

1. Les amorces doivent s'apparier chacune sur un brin différent, avec leur extrémité 3' tournée vers l'intérieur de la région. L'amorce A est identique aux 18 premiers nucléotides du brin supérieur : elle s'apparie au brin inférieur et son allongement progresse vers la droite, vers l'intérieur de la région. L'amorce D est le complémentaire inversé des 18 derniers nucléotides du brin supérieur : elle s'apparie à la fin du brin supérieur et son allongement progresse vers la gauche. Les amorces B (complémentaire inversé du début) et C (identique à la fin) s'apparient aux bonnes extrémités, mais leur allongement s'éloigne de la région. Le couple A + D convient.

2. $N = 50 \times 2^{20} = 50 \times 1\,048\,576 = 52\,428\,800$, soit environ $5{,}2 \times 10^7$ molécules.

3. $N = 50 \times 1{,}9^{30} \approx 1{,}15 \times 10^{10}$ molécules. À 100 %, on aurait $50 \times 2^{30} \approx 5{,}4 \times 10^{10}$ : le rendement réel donne environ 4,7 fois moins de molécules.

4. Un cycle dure $30 + 30 + 60 = 120\ \text{s}$. Pour 30 cycles : $30 \times 120 = 3\,600\ \text{s} = 60\ \text{min}$ (sans compter les changements de température).

5. On cherche $50 \times 2^n \geq 10^6$, soit $2^n \geq 20\,000$. Or $2^{14} = 16\,384$ (trop petit) et $2^{15} = 32\,768$. Il faut donc 15 cycles (soit $50 \times 32\,768 = 1\,638\,400$ molécules).

1. Ce lot est le témoin : les bactéries sans plasmide ne forment aucune colonie en présence d'antibiotique (0 et 0). La résistance observée dans les autres lots vient donc bien du plasmide.

2. Les bactéries transformées sont celles qui poussent en présence d'ampicilline (le gène $\text{amp}^R$ est porté par tous les plasmides) : 120 colonies sur 5 100, soit $\frac{120}{5\,100} \approx 2{,}4\,\%$.

3. Sur les 120 colonies résistantes à l'ampicilline, 95 poussent aussi avec la tétracycline : le gène $\text{tet}^R$ de leur plasmide est intact, donc le plasmide s'est refermé sans insert. Les $120 - 95 = 25$ autres sont résistantes à l'ampicilline mais sensibles à la tétracycline : l'insertion de l'ADN étranger a interrompu le gène $\text{tet}^R$. 25 colonies sont recombinantes. Pour le plasmide non coupé, les 150 colonies poussent sur les deux milieux, comme attendu.

4. $\frac{25}{120} \approx 20{,}8\,\%$ des bactéries transformées sont recombinantes.

5. On repère sur la boîte « ampicilline » les colonies qui n'ont pas poussé sur la boîte « ampicilline + tétracycline » (par report des colonies sur le second milieu), puis on les cultive.

1. Exons : $150 + 420 + 330 + 240 = 1\,140$. Introns : $800 + 1\,200 + 1\,500 = 3\,500$. Longueur du gène : $1\,140 + 3\,500 = 4\,640$ paires de nucléotides.

2. La région codante compte 1 140 nucléotides, codon stop compris : $\frac{1\,140}{3} = 380$ codons, dont un codon stop. Il y a donc $380 - 1 = 379$ acides aminés.

3. Les bactéries n'ont pas le système qui retire les introns du premier ARN. Avec le gène complet, l'ARNm contiendrait en plus les séquences des introns (3 500 nucléotides) : les codons lus seraient faux. Par exemple, le premier intron compte 800 nucléotides, un nombre qui n'est pas un multiple de 3 ($800 = 3 \times 266 + 2$), donc il décale le cadre de lecture. Le polypeptide ne serait pas celui de la protéine P.

4. On extrait les ARNm de cellules qui expriment le gène P (cellules où il est très actif) et on les copie en ADN grâce à la transcriptase inverse, puis on synthétise le second brin. L'ADNc obtenu est dépourvu d'introns : il mesure 1 140 paires de nucléotides, soit $\frac{1\,140}{4\,640} \approx 24{,}6\,\%$ de la longueur du gène.

5. Il faut le placer sous le contrôle d'un promoteur actif chez la bactérie (et sur un vecteur capable de se répliquer), pour que l'ARN polymérase bactérienne le transcrive.

1. Le site EcoRI est palindromique : les deux extrémités de l'insert (comme les deux extrémités du plasmide ouvert) portent la même extrémité cohésive AATT. Chaque extrémité de l'insert peut donc s'apparier avec l'une ou l'autre extrémité du plasmide.

2. Orientation 1 : l'extrémité X est du côté du site BamHI du plasmide. La distance entre les deux sites BamHI est $200 + 500 = 700$ pb (de l'insert à la jonction, puis de la jonction au site du plasmide). Les fragments sont $700$ et $5\,000 - 700 = 4\,300$ pb. Orientation 2 : le site BamHI de l'insert est à $1\,000 - 200 = 800$ pb de la jonction proche du site BamHI du plasmide, donc à $800 + 500 = 1\,300$ pb de ce dernier. Les fragments sont $1\,300$ et $5\,000 - 1\,300 = 3\,700$ pb.

3. Clone 1 : 4 300 + 700 pb, soit un plasmide recombinant dans l'orientation 1. Clone 3 : 3 700 + 1 300 pb, soit un plasmide recombinant dans l'orientation 2. Clone 2 : un seul fragment de 4 000 pb : le plasmide n'a pas reçu d'insert (il s'est refermé sur lui-même) ; il n'a qu'un site BamHI et donne une seule molécule linéaire de 4 000 pb.

4. On coupe le plasmide et l'insert avec deux enzymes différentes (par exemple EcoRI et HindIII) donnant des extrémités cohésives différentes : l'insert ne peut s'apparier que dans un seul sens. Cela empêche aussi le plasmide de se refermer sur lui-même.

1. Dans l'allèle A, on lit CCTGAGG : cela correspond bien à CCTNAGG avec N = G. Dans l'allèle S, la séquence devient CCTGTGG : la 5e base est T alors que le site exige un A. Le site n'existe plus : MstII ne coupe pas le produit de PCR de l'allèle S. La mutation GAG en GTG (A en T) a fait disparaître le site.

2. Le produit de l'allèle A est coupé en 1 100 pb et 200 pb ; celui de l'allèle S reste entier (1 300 pb). Un individu A//A donne 1 100 et 200 ; un individu S//S donne 1 300 seule ; un individu A//S donne les trois bandes (1 300, 1 100 et 200). Les parents ont trois bandes : ils sont A//S. Enfant 1 : A//A. Enfant 2 : S//S. Enfant 3 : A//S. L'enfant 2 est atteint, les deux parents sont hétérozygotes et sains.

3. Chaque parent A//S produit deux types de gamètes, A et S, en proportions égales.

La probabilité que le quatrième enfant soit S//S est $\frac{1}{4}$, indépendamment des enfants précédents. Il y a $\frac{1}{2}$ de chances qu'il soit A//S (porteur) et $\frac{1}{4}$ qu'il soit A//A.

4. La PCR multiplie la région du gène à analyser : il suffit d'une très faible quantité d'ADN (quelques cellules) pour obtenir assez de copies, visibles sur le gel. Sans amplification, la région d'intérêt serait noyée dans le reste du génome.

1. T1 et T2 portent le gène cry (PCR positive) et fabriquent la protéine : 12 ng par g pour T1, 85 ng par g pour T2. La mortalité des larves est de 41,7 % pour T1 et de 93,3 % pour T2, bien supérieure à celle du témoin (6,7 %). Plus la plante produit de protéine, plus la mortalité est élevée.

2. T4 n'a pas le gène (PCR négative), ne fabrique pas la protéine et la mortalité (5,0 %) est celle du témoin : la transformation n'a pas réussi ou le transgène n'a pas été intégré.

3. T3 possède le gène (PCR positive) mais ne fabrique pas la protéine ; la mortalité (8,3 %) ne diffère pas de celle du témoin (6,7 %). Le gène est présent mais non exprimé. Explications possibles : le transgène s'est inséré dans une région du génome où il n'est pas transcrit, ou son promoteur n'est pas actif dans la plante, ou l'ARNm est dégradé avant traduction.

4. La mortalité n'est élevée que pour les lignées qui fabriquent la protéine (T1 et T2) et elle augmente avec la quantité de protéine. La présence du gène seul (T3) ne suffit pas. C'est donc la protéine Cry (et non la simple présence du gène dans l'ADN) qui est associée à la mort des larves : ce résultat est cohérent avec la toxicité de cette protéine annoncée dans le document 1.

5. Le code génétique est quasi universel : la plante lit les codons du gène bactérien comme les siens. Il faut que le gène soit sous le contrôle d'un promoteur actif chez les plantes pour qu'il soit exprimé.

6. Par exemple : évaluer l'effet sur les insectes non visés et sur l'environnement avant toute culture à grande échelle, ou surveiller l'apparition d'insectes résistants à la protéine (en conservant, par exemple, des parcelles non transgéniques à proximité).